抗菌肽的分类
可将其分为6类:
(1)昆虫抗菌肽 昆虫是种群很大的生物种类,抗菌肽的数量难以估量。现在,仅在鳞翅目、双翅目、鞘翅目和蜻蜓目等8个目的昆虫中发现超过200多种昆虫抗菌肽类物质,仅从家蚕这一种昆虫获得了40个抗菌肽基因。
(2)哺乳动物抗菌肽 1989年, 首次从猪小肠中分离到哺乳动物抗菌肽Cecropin P1。目前,从猪中分离出至少18种,绵羊中至少30种,牛中至少30种抗菌肽。人类机体中发现的防御素属于抗菌肽中的一个大家族,根据其氨基酸的空间结构和分泌部位的差别又分为三大类:人α-防御素(humandα-defensin)、人β-防御素(human β-defensin, HβD)、人θ-防御素(humanθ-defensin)[5],现已发现人防御素达35种以上,其中非常重要的防御素有10种。
(3)两栖动物抗菌肽 两栖类动物裸露的具多种功能,在皮肤的分泌物中存在的大量皮肤活性肽具有多样的生物学活性,其中大多数多肽类物质均具有一定的抗微生物活性,在进化上是一类非常古老而有效的天然防御物质,往往归为抗菌肽。在非洲爪蟾中就有十多种抗菌肽,不仅在皮肤颗粒腺表达,也有存在于胃粘膜和小肠道细胞。在非洲爪蟾皮肤中发现的小分子抗菌肽———爪蟾素(magainins)是较早发现的两栖动物抗菌肽,具有很高的抗菌活性,此后相继发现了多种蛙类抗菌肽。据不完全统计,目前已经从无尾两栖动物8个属约40多种两栖类动物的皮肤中提取出了数百种抗菌肽,APD数据库中就收录了其中的548种。大量研究发现蛙类抗菌肽具有协同效应,但不同的蛙类抗菌肽很少具有同源性。
(4)鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的抗菌肽 1986年,从豹鳎分离到一种含有35个氨基酸残基抗菌肽Pardaxin是很早从鱼类分离得到的两亲性阳离子α螺旋结构具有穿膜作用的多肽,该肽是离子型神经毒素,由该肽衍生出了一系列具有比蜂毒素抗菌活性更强,溶血活性更低的抗菌活性肽。1998年, 报道了鲶(Parasilurus asotus)受伤时上皮粘膜细胞层分泌一种19个氨基酸残基的组蛋白H2A抗菌肽parasinⅠ,具有广谱强抗菌活性,其抗菌活性是蛙皮素mainin 2的12~100倍。目前,从鱼类分离得到49种以上抗菌肽。防御素是贻贝等海洋软体动物的重要抗微生物肽,迄今发现的贻贝防御素根据其初级结构、性质和共有的半胱氨酸序列分为Defensin、mytilin和myticin 3种。虾经细菌感染后可诱导多种基因表达,其中含有多种抗菌肽基因。自1997年首次报道甲壳动物抗菌肽氨基酸全序列以来,从甲壳类动物如对虾血细胞中分离出多种抗菌肽。
(5)植物抗菌肽 植物中也存在一些结构上与昆虫、哺乳动物防御素结构相似的植物抗菌肽,称为植物防御素。大多数植物抗菌肽对植物病原具有良好活性,部分植物抗菌肽对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒性。Thi-onins是很早从植物中分离的抗菌肽。
(6)细菌抗菌肽 细菌抗菌肽又称细菌素(bacteriocin),包括阳离子肽和中性肽,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可分泌。细菌中已发现的抗菌肽有杆菌肽(Bacitracin)、短杆菌肽S(Gramicidin S)、多粘菌素E(Polymyxin E)和乳链菌肽(Nisin)4种类型。目前,APD数据库中就收录的细菌素有119种,其中乳酸链球菌肽nisin是由乳球菌产生的含3~4个氨基酸残基的短肽,它是一种耐酸性物质,即使在胃这样低pH环境中稳定性也很高,能抑制革兰氏阳性菌如梭状芽孢杆菌和李氏杆菌。Bacillus spp.产生的杆菌肽mersacidin对“超级耐药菌”———耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)具有良好的抑制作用,通过腹腔给药可以清除MRSA感染小鼠血液、肺、肝、肾、脾等脏器中的细菌,并且对小鼠各器官没有造成明显的损害。
抗菌肽的国内研发
华南农业大学教授黄自然及其研究组从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物(溶菌酶)--抗菌肽,是经过十几年的努力取得的一项首创性科研成果。抗菌肽医药产品即以生物工程方法将抗菌肽纯化为一类新型药物。具有广谱性杀菌作用,并能抑制乙型肝炎病毒的复制。特别是对耐药性细菌,抗菌肽有较强杀灭作用,并能选择性杀伤肿瘤细胞,是一种具有作用靶点及新作用机制的化合物。
南开大学、天津大学和大港油田联手攻关,成功地从苍蝇体内分离出抑制多种病源菌和病毒的抗菌肽。目前多种抑菌实验已经完成,科研人员正在着手进一步纯化从苍蝇幼虫体内提取出的抗菌肽。
中国科学院上海生化与细胞所张永莲等人对名为Binlb的鼠源新基因的功能研究取得突破(批准号:39893320)。该基因只在附睾头部上皮细胞中特异表达具有抗菌功能的多肽,生育旺期表达很高。这是目前*一个发现与附睾防御系统相关的天然抗菌肽,人体也类似,也是国际上发现的*一个与男性生殖系统炎症相关的功能基因,*一次证实附睾具有免疫系统。其研究成果:《大鼠生殖系统中的一个抗菌肽基因》,于2001年3月在《Science》上发表,是我国生命科学基础研究成果*一次在《Science》上刊载。
中国水稻所黄大年教授主持的蚕抗菌肽B基因转化水稻的研究,抗菌肽B基因转化植株表现出对白叶枯病合细条病的抗性有明显提高,为水稻白叶枯病的抗性育种提供了一条新的途径.将该基因导入推广品种,可以获得农艺性状保持优良.另外,转基因第二代植株仍然表现对白叶枯病合细条病的抗性。
中国农业科学院生物技术研究中心研究员贾士荣完成了抗菌肽Cecropin B及Shiva A基因的合成,构建了表达载体,并将这些基因成功地导入我国七个马铃薯主栽品种(品系),获得1050个转基因株系,经多年多点抗病性鉴定,初步筛选出三个较起始品种抗病的株系。
黄亚东,郑青,王林川,廖富苹,黄自然等采用病毒载体pAcGP67B,通过PCR点突变技术将柞蚕抗菌肽基因起始密码ATG删除以利于形成信号肽切除位点的编码序列。gp67信号肽的插入能引导表达产物分泌到细胞外而便于表达产物的鉴定及其生物活性的测定,对柞蚕抗菌肽D基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达。
抗菌肽的制备的方法有哪些 具体怎么做?
提取纯化具有抗菌活性的多肽物质,并对其进行抑菌活性的研究。方法用甲醇进行粗提取。对提取的甲醇浓度、甲醇用量、浸提时间和浸提次数,采用L9(3^4)正交实验,以蛋白含量作为指标,确定很佳提取条件。得到的粗提物经Sephadex G-75、Sephadex G~50和Sephadex G-25凝胶过滤进一步分离纯化获得抗菌肽。对抗菌肽进行氨基酸组成分析,采用杯碟法进行抑菌活性研究。结果提取林蛙抗菌肽的很佳工艺条件:甲醇浓度80%、甲醇体积为蛙皮重量的6倍、提取时间24h,提取次数3次。提取的粗提物经凝胶过滤后得到抗菌肽。抗菌肽的氨基酸组成中,碱性氨基酸占22.1%。酸性氨基酸占13.9%。抗菌肽对细菌的很低抑菌浓度分别为:枯草杆菌73.25μg/ml,金黄色葡萄球菌51.75μg/ml,大肠杆菌51.75μg/ml,铜绿假单胞菌51.75μg/ml。结论经甲醇提取和凝胶过滤可从中国林蛙皮肤得到抗菌肽。该抗菌肽为碱性多肽,对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌均有抑制作用。
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